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H·H小课堂|PCR实验成败之变温速率
2017-08-17


Hi,大家好! 我是Dr.皇,很高兴和大家见面,今后会有不定期实验小知识和大家分享,希望能对大家的科研之路有所帮助!


学生物的童鞋们,PCR实验你一定听说过或做过,可是,当各种假阳性、各种扩增、各种拖带挥之不去、不清自来的时候,该如何是好呢?


各位有福了,Dr.皇今天就来讲一讲PCR反应中变温速率对实验结果的影响。



PCR(Polymerase chain reaction:聚合酶链反应)即是在体外模拟体内DNA复制的过程,用一对寡聚DNA作为引物,通过加温变性—退火—DNA合成这一周期的多次循环,使目的DNA片段得到扩增。


小伙伴们常常遇到以下问题:
  • 按照文献开展实验,却无法重复实验结果?

  • OMG,一上午才能跑三块板子,回头望望堆成山还没P的板子,心累……

  • 模板、引物、酶乃至整个反应体系都确认无误,可时不时总会出现假阳性或假阴性?

其实这个时候你就要考虑考虑我们的PCR仪的温控是否合适呢??

Tips

  ----------因为PCR仪的变温方式和性能是PCR技术的核心与关键,直接决定了PCR的效率和DNA产物的质量与数量哦~~


今天我们着重讲一下温控的主要参数之一:变温速率,也就是PCR反应循环中升降温速度。


做过PCR实验的小伙伴最头疼的莫过于出现非特异性扩增,也就是我们常说的假阳性,而造成这一结果的原因有很多。

1.引物合成特异性差

2.模板或引物浓度过低

3.酶量过多

4.Mg2+浓度偏低

5.循环次数过多

6.升温速率过低

……

其实所有的可能性都是在围绕引物和模板配对这一环节,也就是我们常说的退火阶段,包括退火温度和退火时间。此阶段,PCR反应体系相对复杂,也是最为敏感的时期,每个因素都会影响到实验的结果。

现如今PCR技术较为成熟,商品化的试剂盒随处可见,因此大多数的非特异性扩增都是人为操作造成的。

但有一点,小伙伴们肯定没有注意过,那就是变温速率对实验结果的影响!

理论上来说,同一扩增片段,在退火温度确定的条件下,退火时间越短,越有利于提高准确配对的引物与模板的比例,进而提高产物的特异性。


因此,实验当中的假阳性非特异性扩增很有可能是由于升温速率过低导致的哦~~~

常规的PCR仪大多都是采用半导体加热制冷器,根据帕尔贴效应,电流流过两种不同导体界面时,将从外界吸收热量,或向外界放出热量,放热或吸热的大小由电流的大小来决定,从而控制PCR样品管的温度。


而温度控制模块的材质是关键,现常见的材质有铝合金和银(镀金)。铝合金材质的样品槽升降温速率相对较低,一般在2℃/s~4℃/s。而银(镀金)材质的样品槽由于导热性能更好,升降温速率可达到6℃/s ~ 8℃/s。因此同样一组PCR实验在铝合金的样品槽上需要40~60分钟,而在银(镀金)样品槽上不到30分钟就可以搞定了!不用Dr.皇给您算,这一天省下的时间可是相当可观呢!


       铝合金

金色铝合金(表面防氧化层)

                                                     纯银镀金


实际上,同一品牌下不同档次的PCR仪划分标准就是升降温速率这一指标!


P C R 仪 中 的 贵 族 血 统

德国耶拿(analytik jena),专注PCR技术近30年,并于2009年收购了以红色PCR著称的Biometra公司,致力于为广大客户提供高品质的产品和服务。

2014年9月,Biometra TAdvanced 系列PCR仪横空出世,旨在打造设定PCR仪的金标准!



快速精准的温度控制

  • 镀金纯银样品槽结合先进只能的RAC(Ramping-Accuracy-Control)电子温控技术,其中TAdvanced 96SG纯银镀金槽更将最大升温速率提升到了8℃/s,平均升温速率也可以达到7℃/s。这一数据在业内同一档次的PCR仪中是无法比拟的!


  • 精准:采用具有25年制造经验的瑞士高端PT100传感器,配合先进的电子元件能为PCR仪带来±0.1℃的温度准确性,优异的温度准确性带来优异的温度均一性。此外,样品槽实际温度与设定温度相比,没有温度过冲或下冲的现象,可为用户提供稳定可靠的PCR扩增结果。


  • 耐用:样品槽采用全面的密封设计,无论是样品溶液还是冷凝水,都不会渗漏到样品槽下面的帕尔贴控温元件以及其他电子元件,可有效延长仪器的使用寿命。




看过视频的小伙伴,是不是对“独特的线性温度梯度”是否好奇呢?~~


下期H·H小课堂会给大家带来PCR实验成败之温度梯度,敬请期待吧!




广州皇河仪器科技有限公司


皇河科技,拥有众多国际知名品牌的签约总代理授权。总部位于广州,并在深圳,珠海,汕头设有办事处。专业的销售,技术支持和售后服务团队,为您提供最专业的售前咨询、应用安装及完善的售后服务支持。


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